Edición alélica de precisión para la corrección de la trisomía 21: una estrategia terapéutica de CRISPR/Cas9 en el síndrome de Down

El síndrome de Down (SD), es causado por la presencia de una copia extra del cromosoma 21 (conocida como trisomía 21), representa la aneuploidía viable más común en humanos, con una incidencia aproximada de 1 por cada 700 nacimientos. Aunque los avances en diagnóstico prenatal y en la comprensión clínica y molecular del síndrome han sido notables en las últimas décadas, las estrategias terapéuticas dirigidas a eliminar directamente la causa genética primaria han sido hasta ahora inalcanzables.

Una investigación recientemente publicada en PNAS Nexus por científicos de la Universidad de Mie, Japón, liderados por el Dr. Ryotaro Hashizume, ha logrado dar un paso significativo hacia dicho objetivo. A través de una aplicación innovadora de la edición genética mediante ¨CRISPR/Cas9¨ el equipo consiguió ¨eliminar de manera selectiva la copia supernumeraria del cromosoma 21 en células humanas¨, utilizando una estrategia basada en la especificidad alélica. Esta intervención no sólo corrigió el número cromosómico en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), sino también en células diferenciadas como fibroblastos dérmicos, e incluso en células no proliferativas.

La patogénesis del síndrome de Down está relacionada con la dosis génica incrementada derivada de tener tres copias de los genes ubicados en el cromosoma 21.

Esta sobreexpresión altera numerosos procesos celulares; incluyendo el desarrollo del sistema nervioso central, la función mitocondrial, el metabolismo oxidativo y la transcripción génica global. Diversos estudios han identificado que, más allá de la sobreexpresión de genes en HSA21, existe un ¨desequilibrio transcripcional¨ generalizado en otros cromosomas, lo que sugiere un impacto sistémico del exceso cromosómico.

Pese a ello, la mayoría de las propuestas terapéuticas se han centrado en aliviar síntomas secundarios, sin abordar el origen genético subyacente. Intentos previos para suprimir el cromosoma extra, como la inserción del gen XIST para inducir inactivación cromosómica, han demostrado eficacia parcial, pero requieren modificaciones genéticas complejas y difícilmente aplicables en humanos. Por ello, la posibilidad de eliminar directamente la tercera copia del cromosoma 21 representa un avance conceptual y técnico sin precedentes.

El enfoque desarrollado por Hashizume y su equipo utiliza la capacidad del sistema CRISPR/Cas9 no solo para inducir cortes en el ADN, sino para hacerlo con una selectividad basada en las diferencias genéticas entre las tres copias del cromosoma 21; debido a las técnicas del ¨Haplotipo genómico¨, los investigadores identificaron regiones únicas de la copia M2 (una de las dos copias maternas presentes en la línea celular utilizada) que podían ser blanco de CRISPR sin afectar las otras dos copias.

A partir de esta información, diseñaron un conjunto de guías de ARN (gRNA) específicas para esas secuencias. Estas guías fueron codificadas junto con la proteína Cas9 en un solo vector plasmídico; el cual, se introdujo en las células mediante ¨electroporación¨. La coexpresión de múltiples gRNAs permitió inducir ¨rupturas de doble cadena en numerosos sitios distribuidos en el cromosoma objetivo¨, fragmentándose hasta provocar su pérdida completa durante la división celular.

Lo notable del estudio fue demostrar que la ¨frecuencia de eliminación¨ del cromosoma estaba directamente relacionada con el número de sitios de corte introducidos: a mayor número de rupturas, mayor probabilidad de que la célula elimine el cromosoma afectado. Esta correlación refuerza el concepto de que ¨la edición cromosómica no requiere una mutación única crítica, sino una estrategia de saturación dirigida¨.

La edición génica por CRISPR suele activar mecanismos celulares de reparación del ADN, que intentan restaurar las regiones dañadas y, por tanto; pueden contrarrestar el intento de eliminar un cromosoma. Para sortear esta limitación, los autores implementaron una estrategia adicional: ¨inhibieron temporalmente dos genes clave en las vías de reparación de rupturas de doble cadena¨, POLQ (vía MMEJ) y LIG4 (vía NHEJ), utilizando ARN de interferencia (siRNA).

Esta supresión transitoria de la reparación genómica duplicó (en algunos casos triplicó) la tasa de eliminación cromosómica, al impedir que la célula pudiera reparar eficazmente los múltiples daños inducidos. La intervención fue lo suficientemente breve (48 horas) como para no afectar de manera permanente la viabilidad celular, pero efectiva para inclinar la balanza hacia la pérdida del cromosoma objetivo.

Una vez corregido el número cromosómico, los investigadores realizaron un análisis funcional exhaustivo de las células que habían perdido la copia extra. A través de secuenciación de ARN (RNA-seq), observaron que el perfil de expresión génica en estas células se aproximaba de forma significativa al de células disómicas normales.

Entre los genes con expresión corregida se encontraron muchos involucrados en la neurogénesis, el desarrollo del sistema nervioso central y la diferenciación neuronal, lo cual es particularmente relevante considerando que el retraso cognitivo y la disfunción cerebral son características cardinales del síndrome de Down. Paralelamente, las células rescatadas mostraron ¨reducción en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)¨, mejora en la proliferación celular y una recuperación del metabolismo energético.

Estos resultados sugieren que la eliminación del cromosoma 21 no solo corrige una anomalía estructural, sino que ¨restablece la funcionalidad celular en múltiples niveles¨, proporcionando un modelo para futuras intervenciones terapéuticas en otras condiciones aneuploides.

Un hallazgo particularmente innovador del estudio fue demostrar que esta técnica también es efectiva en células somáticas ya diferenciadas, como fibroblastos dérmicos. Incluso en condiciones en las que las células no se estaban dividiendo activamente, los investigadores observaron tasas de eliminación cromosómica superiores al 3%, lo que indica que el mecanismo no depende exclusivamente del ciclo celular activo.

Esta propiedad extiende el potencial terapéutico de la estrategia, al permitir su aplicación en tejidos maduros del organismo, donde la mayoría de las células no se encuentran en división constante, y representa una ventana de oportunidad para intervenciones post-natales o en adultos.

Si bien el enfoque ha mostrado gran precisión, aún existen desafíos importantes antes de su posible aplicación clínica. En algunos casos, los cortes dirigidos al alelo M2 provocaron daños menores en los otros alelos, especialmente cuando existía una alta similitud de secuencia. Además, en células donde el cromosoma objetivo no fue eliminado, se detectaron mutaciones residuales en las regiones reparadas, que podrían acumularse si la técnica se aplicara repetidamente.

Otro aspecto a considerar es la posibilidad de generar disomías uniparentales si se eliminan de forma incorrecta los alelos no deseados, lo que podría tener consecuencias epigenéticas.

Finalmente, ¨la eficiencia del método varía entre líneas celulares y tipos celulares¨, por lo que será necesario validar y adaptar la estrategia a un contexto más amplio, incluyendo células neuronales, gliales y otros tejidos relevantes en el síndrome de Down.

Este estudio constituye una demostración de concepto sólida para el uso de edición genómica alélica específica como herramienta terapéutica en enfermedades aneuploides. Aunque aún es prematuro considerar su aplicación en embriones humanos o terapias in vivo, los resultados abren una vía inédita para la investigación de intervenciones curativas en síndromes como el de Down.

Entre los próximos pasos se encuentran el desarrollo de vectores de entrega eficientes para tejidos humanos, la exploración de métodos alternativos que no dependan de rupturas de ADN (como la edición epigenética sin corte), y la validación de seguridad genómica a largo plazo mediante secuenciación de nueva generación.

La posibilidad de corregir una aneuploidía humana mediante una técnica precisa, específica y funcionalmente efectiva marca un antes y un después en el campo de la genética terapéutica.

El trabajo de Hashizume y colaboradores representa un avance técnico y conceptual hacia la posibilidad de intervenir directamente en el núcleo del problema genético del síndrome de Down, con aplicaciones que podrían, en el futuro, transformar el abordaje clínico de esta y otras alteraciones cromosómicas.

Fuente: Masscience

NotiBolivia

Bolivia